大连化学物理研究所赵宗保研究员团队（生物质高效转化研究组1816组）李青、郭潇佳、王雪颖等在非天然辅酶领域再获新突破。近期，该团队创制了非天然辅酶依赖型细胞色素P450酶，并构建脂肪酸羟化反应体系。相关成果发表在国际知名期刊Journal of Energy Chemistry上：Creation of cytochrome P450 catalysis depending on a non-natural cofactor for fatty acid hydroxylation。

细胞色素P450酶催化功能多样，反应类型及底物范围广泛，但细胞色素P450酶的活性依赖于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，因NADPH在宿主细胞中受到严格调控，且大规模生物催化成本高昂，细胞色素P450酶的应用受限。为突破调控天然辅酶的局限，赵宗保研究团队近十余年来致力于创建和应用基于非天然辅酶的生物正交代谢体系。前期工作中，该团队通过交叉筛选获得了偏好人工辅因子烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（nicotinamide cytosine dinucleotide, NCD）的苹果酸酶突变体，成功构建依赖于NCD的正交氧化还原体系，并将NCD关联的氧化还原配对拓展至亚磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶等氧化还原元件。创制非天然辅酶还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCDH）依赖型细胞色素P450酶，实现其辅酶消耗与内源能量代谢解耦联，具有重要意义。

构建NCDH依赖型细胞色素P450酶并用于脂肪酸羟化催化反应，研究人员做了三方面的重要工作：第一、以来源于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450 BM3为模板，对其烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）结合口袋进行定向进化，通过半理性设计及改造，获得了两个偏好利用还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCDH）的P450 BM3突变体，氧化底物探针12-(对硝基苯氧基)-十二烷酸的催化效率超过15,000 M⁻¹ s⁻¹，NCDH偏好性提高640倍。第二、进一步将突变体与NCD依赖型甲酸脱氢酶融合，成功构建以甲酸盐为电子供体，NCD特异的P450融合酶催化的脂肪酸羟化。第三、通过研究P450 BM3突变体和融合酶的酶催化性能，都与天然P450 BM3利用NADPH时的脂肪酸链长偏好性相似，且对月桂酸次末端羟基化也有相似的区域选择性。

赵宗保研究团队创制的NCDH偏好型P450 BM3突变体及其融合体具有强大的催化能力，可催化广泛的底物及反应类型，为设计具有正交氧化还原电子系统生物催化过程的先进的细胞工厂，提供令人兴奋的希望。

能源生物技术平台在此工作中提供了有力支撑：高通量细胞培养与活性分析系统应用在本文及前期酶的定向进化工作中，降低劳动强度，加快筛选速度。